中国药理学与毒理学杂志

期刊导读

薤白多糖提取分离提纯及与作用研究

来源:中国药理学与毒理学杂志 【在线投稿】 栏目:期刊导读 时间:2021-04-28

薤白是百合科葱属多年生草本植物,别名小根蒜、小根菜等,广泛分布于东亚地区。薤白是一种药食两用植物,备受中日韩三国人们的喜爱[1]。中医学认为,薤白味辛、苦,性温,无毒,具有理气、宽胸、通阳之功效,常用于心血管疾病组方中[2]。临床研究显示,薤白多糖是薤白的主要有效成分,现代医学研究显示其主要成分为果糖、葡萄糖,相关研究较少。本文探索薤白多糖提取、分离提纯方法,并分析其对DNA作用。

1 材料及方法

1.1 仪器与试剂、实验材料

药剂科自购的产自江苏某地薤白饮片,经鉴定为百合科葱属植物小根葱的干燥麟茎。实验动物清洁级4周龄小鼠,严格遵守动物伦理规定,数量不限。主要仪器:电热恒温鼓风干燥起、台式离心机、紫外线可见光光度计、恒温水浴锅等。试剂:无水乙醇、牛血清白蛋白胨等标准品,吡啶、盐酸羟胺等色谱纯。

1.2 方法

1.2.1 薤白多糖提取、分离提纯

取薤白鳞茎200 g,经加热回流脱脂,获得薤白粉末156.42 g。参照文献提出的薤白多糖提取优化条件[3],温度87.2 ℃,水料比12.2 mL/g,提取3次102 min,合并提取浓缩液,加乙醇定容到40%浓度的薤白多糖乙醇溶液。5 000 r/min离心10 min,-40℃冻干得到粗多糖AMP40及上清液,浓缩上清液去乙醇,加乙醇定容到60%乙醇溶液,离心冻干得粗多糖AMP60及上清液,同法操作得粗多糖AMP80及上清液,弃上清液,最终获得粗多糖。参照文献提出的DEAE-52-纤维素交换柱色谱法进行初步的分离纯化,用葡聚糖凝胶色谱法纯化获得的初步多糖[4]。称量Sephadex G-100凝胶干粉,加30倍体积的水,粉碎浴5 h冷却,清洗2~3次,湿法装柱,水平衡处理24 h备用。取DEAT-52纤维素纯化的多糖各20 mg,加2 mL水溶解,湿法上加到SephadeG-100层析柱,洗脱收集各类多糖,在490 nm处吸收值检测各类多糖的含量。样品处理方式分为预处理、过滤、脱色和透析等多种方式,如已经称重的白色干燥薤白粉末需要用80%的乙醇进行2次回流,每次回流时间为2h,以消除小分子糖、苷类及生物碱等物质。过滤过程是对提取液进行减压抽滤的过程。结果显示纯化的薤白多糖AMP40-1、AMP40-2、AMP60-1、AMP80-1得率为69.425%、75.340%、62.692%、82.442%,以葡萄糖作为标准品,绘制总糖含量的线性回归方程,计算AMP80-1的总糖含量最高达到92.561%~99.195%。采用色谱法、紫外光谱分析薤白多糖成分、纯度。多糖含量测定公式为:

多糖含量=c·V·D/W·V1

在上述公式中,c指代样品溶液稀释后所测得的吸光度对应的浓度(μg/ml);D为样品溶液的稀释倍数;W为样品的质量,V为水提液定容后的体积。下图所示的内容为未经脱色处理的粗多糖色谱图

图1 未经处理的色谱图

如图所示,图中的刻度值为-0.002、0.000、0.002、0.004、0.006、0.008、0.010与0.012,。横轴为时间,纵轴为峰面积。

1.2.2 DNA影响分析

常规方法分离小鼠股骨BMSCs,将培养的85%BMSC,0.25%胰酶消化吹打后接种到孔板上。将BMSC分为空白组、对照组、实验组(剂量100μL、剂量为12.5、25、50、100 μg/mL)薤白多糖。每个浓度加入6个复孔,培养3日后,弃50 μL的培养基。空白对照组不进行辐射,其余辐射处理,2日1次,每次2 Gy,连续5次。对照组加生理盐水。每次辐射都更换相应培养基,末次辐射前4 h,加4 mL间充质干细胞培养基,37 ℃培养,末次辐射,弃培养基,PBS洗涤1次,胰酶消化1 min,加3 mL胎牛血清终止,吹打均匀,转到EP管中,2 000 r/min离心10 min,弃液体加KCl溶液7 mL混匀,37 ℃水浴50 min,加3 mL固定液混匀,2 000 r/min离心10 min,弃上清液,加5 mL固定液,混匀室温下放置15 min,2 000 r/min离心10 min,加2 mL固定液振荡混匀,4℃保存72 h。预冷载玻片,加BMSC后干燥,姬姆萨染色15 min,清水处理,干燥,高倍镜下观察分析畸变率,用免疫荧光法检测各组细胞+/16( CDE9 )焦点簇数目,分析DNA损伤。

1.3 观察指标

不同组对象的畸变率、焦点簇数目。畸变率为畸变数量在样本总数中的所占比例。

1.4 统计学处理

SPSS20.0软件统计学计算,不同组对象的畸变率、焦点簇数目多组比较采用F检验,每组两两比较采用t检验。

2 结果

出峰良好,如图2所示,

图2 紫外谱图

根据本次研究的研究结果,AMP40-1、AMP40-2、AMP60-1、AMP80-1均未见吸收峰,提示不含有核酸、蛋白质,提示为单纯的多糖组分,证实多糖中含有阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖。空白组、对照组、不同浓度的薤白多糖溶液处理的实验组的畸变率、焦点簇数目随着薤白浓度的上升呈逐渐下降趋势,差异有统计学意义(P<0.05);实验组畸变率、焦点簇数目低于空白组、对照组,差异有统计学意义(P<0.05)见表1。

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