肠道青春双歧杆菌体外传代稳定性研究

练光辉1卢放根1刘小新2谭鲜2

(1中南大学湘雅二医院消化内科湖南长沙;

2湖南中南一泰药物研究开发有限公司湖南长沙)

【摘要】目的考察肠道青春双歧杆菌的传代稳定性。方法?从生长特性、形态学、生化特点、代谢物成分以及核酸组成观察双歧杆菌在传代过程中的变化。结果? 双歧杆菌在传代10代其生长特性、生化特点、代谢物组成以及遗传特点无明显改变。结论? 青春双歧杆菌在传代10代以内能安全用于生产目的。

【关键词】双歧杆菌? 传代? 稳定性

,LUFanggen1,,TheSecondXiangyaHospitalofCSU,ChangshaHunan,China;2CentralSouthYitaiDrugDevelopmentLimitedCompa-ny,ChangshaHunan,China

haracteristicsofgrowth,morphologicalfeatures,biochemicalcharacters,,morphologicalfeatures,biochemicalcharacters,tions.

【Keywords】?Bifidobacterium;Serialpassage;Stability

双歧杆菌在肠道内占据优势,由此抑制肠道致病菌和条件致病菌的定植和生长,还通过刺激局部的黏膜组织分泌免疫物质如分泌型免疫球蛋白(sIgA)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、重组人干扰素γ(IFN-γ)、白细胞介素12(IL-12)、一氧化氮(NO)等来发挥其防御作用[1,2]。

双歧杆菌在治疗消化道疾病中的作用已经被广大医疗工作者接受,国内外双歧杆菌制成的制剂开发处于蓬勃发展的阶段,一些复合双歧杆菌活菌制剂如整肠生、金双歧、培菲康等已经广泛应用于临床用于调节肠道菌群。然而对于双歧杆菌在储存传代中的变化知之甚少,而菌株的传代稳定性的情况也是决定该菌株能否实现从实验室到工业生产的关键。如果一株细菌在传代过程中容易发生变异,就局限了它的使用次数,增加生产的成本,而且制剂的安全性及有效性也受到质疑,所以在进入生产前必须确定它的安全传代数。

本研究拟从自健康儿童粪便中筛选出一株肠道正常双歧杆菌,并对种子菌进行传代培养,从生长特性、形态学、生化特点、代谢物成分以及核酸组成进行安全传代数进行考察。

1 试剂与方法

1.1试剂?MRS、TPY培养基(购自Fluka公司);API-20A试纸条(法国梅里埃);乙酸、乳酸、丙酸、丁酸为色谱纯;其余未说明试剂均为国产分析纯。

1.2方法

1.2.1 双歧杆菌分离纯化按常规双歧杆菌分离培养技术,API20A试纸条检测其生化特性。

1.2.2?(鸟嘌呤+胞嘧啶)所占百分比测定?①选用热裂解法,采用苯酚氯仿抽提DNA;②热变性温度法测定细菌DNA鸟嘌呤+胞嘧啶(G+C)mol%。

1.2.3细菌代谢物测定①偏磷酸法制备挥发性脂肪酸(VFA);甲醇硫酸法制备非挥发性脂肪酸(NVFA)。②气相色谱法测定细菌培养液中脂肪酸的含量。

1.2.4 电镜下形态观察分别按扫描电镜和投射电镜要求进行标本处理。

2? 结果

2.1青春双歧杆菌及传代过程中的形态学变化通过厌氧培养在培养基中菌落主要有(灰)白色圆形、淡黄色类圆形、白色扁平、淡黄色扁平等各种形状。新分离的肠道青春双歧杆菌菌落肉眼呈1～2mm的圆形,微隆、(灰)白色边缘整齐的菌落。油镜下为革兰阳性的长杆菌,染色均匀,大小基本一致,菌体偶见有分叉现象,如图1A;在有氧培养下生长不良,菌落明显变小,为针尖大小,半透明。经过传代培养以后,肉眼形态无明显改变,从第5代开始光镜下形态呈菌体变粗短,染色无明显变化;从第10代开始染色不太均匀,表现在菌体两端染色较深,但菌体中央染色变浅,稍呈淡红色,如图1B。传代后细菌耐氧性增强,有氧培养下生长逐渐良好,表现为菌落形态变大,生长时间缩短。

2.2生物化学鉴定结果?采用API-20A系统标准。青春双歧杆菌显示对靛基质、尿素、明胶不分解,触酶试验阴性,根据生化反应结果,结合革兰染色该菌编码定为47757732,参照熊德鑫教授编著的《临床厌氧菌检验手册》中提供的数值模式,符合青春双歧杆菌的生化特性。传10代以后,对棉子糖反应强度减弱,但根据标准仍为阳性,其余生化反应无变化。

2.3?青春双歧杆菌代谢产物的检测结果?经质谱分析主要新分离双歧杆菌非挥发性酸为乳酸和琥珀酸,挥发性脂肪酸主要为乙酸,符合青春双歧杆菌对碳水化合物发酵代谢的特征,如图2、3。新分离双歧杆菌与传10代的细菌培养液NVFA/VFA谱形相似，波峰、波面积接近,谱形和峰大小相同,证明传10代无新的非挥发性及挥发性脂肪酸产生,也无丢失情况。